استرپتاویدین سیگما CAS 9013-20-1

1. استرپتاویدین را بشناسید
استرپتاویدین (SA)، یک پروتئین ترشح شده از Streptomyces avidini، دارای وزن مولکولی تقریباً 65{2}}66 کیلو دالتون و نقطه ایزوالکتریک حدود 6.0 است. این یک پروتئین تترامر است که از چهار زیرواحد همولوگ تشکیل شده است که هر یک دارای یک محل اتصال بیوتین مستقل است - به این معنی که یک مولکول استرپتاویدین می تواند به طور همزمان به چهار مولکول بیوتین متصل شود. ثابت تفکیک (Kd) بین این دو تا حدود 10-15 M است که یکی از قوی ترین برهمکنش های بیولوژیکی غیر کووالانسی شناخته شده است و می تواند به عنوان دقیق ترین "مکانیسم قفل مولکولی" در طبیعت در نظر گرفته شود.

در مقایسه با آویدین به دست آمده از سفیده تخم مرغ، مزایای بی نظیری دارد:

این شامل تغییرات گلیکوزیلاسیون نیست، به طور کلی از نظر الکتریکی خنثی است، بنابراین در شرایط فیزیولوژیکی اتصال غیر اختصاصی بسیار کم، پس‌زمینه آزمایشی تمیز، و نسبت سیگنال به- عالی است. علاوه بر این، مقاومت عالی آن در برابر دناتوره شدن و تخریب پروتئاز، و همچنین توانایی آن در مقاومت در برابر PH شدید، دماهای بالا (70-80 درجه سانتیگراد)، حلال های آلی و عوامل دناتوره کننده معمولی (مانند SDS و اوره)، جایگزین آویدین شده و به "استاندارد طلایی" مسلم در سیستم های اتصال بیوتین تبدیل شده است.

دقیقاً با این ویژگی‌های برجسته است که در زمینه‌هایی مانند علوم زیستی، تشخیص آزمایشگاهی، غربالگری دارو و سنجش زیستی می‌درخشد.

2. تست ایمنی
کاربرد در زمینه تشخیص ایمنی کلاسیک ترین و پرکاربردترین کاربرد آن است. از زمان توسعه آن در اواخر دهه 1970، سیستم بیوتین استرپتاویدین (BAS) به دلیل میل ترکیبی فوق العاده بالا و اثر تقویت آبشاری، به سنگ بنای برچسب گذاری ایمنی و تجزیه و تحلیل ردیابی تبدیل شده است. طبق آمار، حدود 85 درصد از آنالایزرهای شیمی‌لومینسانس رایج از روش‌های تشخیص مبتنی بر BAS استفاده می‌کنند که نشان‌دهنده موقعیت غالب آنها است.

2.1 سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA)

در روش ELISA، ترب پراکسیداز (HRP) یا آلکالین فسفاتاز (AP) را می توان جفت کرد و آنزیم را می توان دقیقاً از طریق آنتی بادی های بیوتینیله به سمت هدف هدایت کرد. HRP بسترهای درخشان TMB، DAB یا ECL را برای تولید سیگنال های شیمیایی یا نوری قوی کاتالیز می کند، در حالی که AP BCIP/NBT، PNPP و سایر بسترها را برای تولید سیگنال های رنگی یا نورتابی شیمیایی پایدار کاتالیز می کند. یک مولکول هدف بیوتینیله می‌تواند به استرپتاویدین برچسب‌دار متعدد متصل شود و به تقویت سیگنال چند سطحی دست یابد و تشخیص اهداف با فراوانی کم را ممکن کند. این فناوری به طور گسترده در ساندویچ و ELISA رقابتی استفاده می شود و سناریوهایی مانند تعیین کمیت پروتئین، تشخیص آنتی بادی، غربالگری پاتوژن و غیره را پوشش می دهد.

2.2 بلات پروتئینی (Western Blot)
در وسترن بلات، اتصال با آنتی بادی های ثانویه بیوتینیله می تواند به طور قابل توجهی شدت سیگنال پروتئین های هدف را در فیلم های انتقال افزایش دهد. در مقایسه با سیستم‌های آنتی‌بادی ثانویه سنتی، سیستم‌های BAS می‌توانند به دلیل ویژگی‌های اتصال چهار ظرفیتی خود، به تقویت سیگنال قوی‌تری دست یابند. علاوه بر این، به دلیل اتصال غیر اختصاصی کم استرپتاویدین، تداخل پس زمینه به طور قابل توجهی کاهش می یابد، و آنها را به ویژه برای تجزیه و تحلیل کمی پروتئین های کم فراوانی مناسب می کند.

2.3 ایمونوهیستوشیمی (IHC) و ایمونوسیتوشیمی (ICC)
استرپتاویدین با برچسب HRP یا با برچسب AP ابزار تقویت سیگنال ترجیحی برای IHC و ICC است. سیستم HRP برای آزمایش‌هایی که به حساسیت تشخیص بسیار بالا نیاز دارند، مناسب است، در حالی که سیستم AP مخصوصاً برای سیستم‌های حاوی مهارکننده‌های HRP (مانند آزید سدیم) یا سناریوهای آزمایشی که نیاز به توسعه رنگ طولانی‌مدت و پایداری سیگنال دارند، مناسب است. با اتصال پروب ها یا آنتی بادی های بیوتینیله به مزدوج های استرپتاویدین، مولکول های هدف را می توان به طور دقیق در بخش های بافتی یا نمونه های سلولی قرار داد.

2.4 ایمونوفلورسانس (IF) و هیبریداسیون درجا (ISH)

استرپتاویدین نشاندار شده با فلورسئین (مانند FITC Streptavidin، PE Streptavidin، APC Streptavidin) یک ابزار تجسم جهانی برای رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس و هیبریداسیون درجا است. نشانگر FITC دارای طول موج تحریک/انتشار تقریباً 494/519 نانومتر است و فلورسانس سبز روشن را نشان می‌دهد. طول موج تحریک/انتشار نشانگر PE حدود 565/578 نانومتر است که "استاندارد طلایی" برای آنالیز فلوسیتومتری چند رنگی است. نشانگر APC طیف قرمز دور را پوشش می‌دهد و تصویربرداری چند رنگ را تسهیل می‌کند. این نشانگرهای فلورسنت می توانند به طور دقیق به آنتی بادی های بیوتینیله یا پروب های اسید نوکلئیک برای دستیابی به تجزیه و تحلیل محلی سازی و تشخیص کمی مولکول های هدف متصل شوند.

2.5 فلوسیتومتری (FACS)

در فلوسایتومتری، استرپتاویدین نشاندار شده با فلورسنت (به ویژه با PE نشاندار) برای تشخیص آنتی ژن های سطح سلولی نشاندار شده با آنتی بادی های بیوتینیله استفاده می شود. روشنایی عالی آن نسبت سیگنال بسیار بالایی-به-نویز ارائه می‌دهد، که می‌تواند به طور موثر جمعیت سلولی با بیان آنتی‌ژن سطح پایین یا سیگنال‌های ضعیف را شناسایی کند. این یک معرف ضروری در تجزیه و تحلیل فلوسیتومتری چند رنگ است.

2.6 سنجش ایمونوسپات مرتبط با آنزیم (ELISPOT)
استرپتاویدین با برچسب AP عملکرد عالی در ELISPOT نشان می‌دهد و برای تجزیه و تحلیل فاز جامد و سیستم‌های رنگ‌آمیزی بافت/سلول مناسب است. می‌تواند به‌طور پایدار تولید سوبسترا سیگنال‌های نقطه‌ای قابل شمارش را برای تشخیص ترشح سیتوکین در سطح سلولی تک‌{{2} کاتالیز کند.

3. خالص سازی پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک
3.1 کروماتوگرافی میل ترکیبی و خالص سازی پروتئین
استرپتومایسین جزء اصلی بسته بندی کروماتوگرافی میل ترکیبی است. پس از برچسب زدن بیوتین به پروتئینی که قرار است خالص شود، آن را با ژل استرپتاویدین آگارز (مانند استرپتاویدین آگاروز/سفاروز) مخلوط می‌کنند و پروتئین نشان‌دار شده از نزدیک به استرپتاویدین روی پرکننده متصل می‌شود. با شستن برای حذف ناخالصی ها و سپس شستن پروتئین مورد نظر در شرایط مناسب (مانند جوشاندن بافر SDS-PAGE، تیمار SDS 0.1 درصد یا تیمار 95 درصد فرمامید+10 mM EDTA در pH 8.2)، محصولاتی با خلوص{{7} بالا بدست می‌آیند.

با در نظر گرفتن تولید صنعتی انسولین انسانی نوترکیب، دانه‌های مغناطیسی استرپتاویدین با کیفیت بالا می‌توانند بیش از 1200 pmol بیوتین آزاد در هر میلی‌گرم را متصل کنند و خلوص پروتئین خالص می‌تواند به بیش از 95٪ برسد.

3.2 رسوب ایمنی (IP) و رسوب ایمنی کروماتین (ChIP)
استفاده از دانه های مغناطیسی استرپتاویدین در رسوب ایمنی به میزان زیادی کارایی آزمایش را بهبود می بخشد. محققان می‌توانند آنتی‌بادی‌های بیوتینیله‌شده را روی دانه‌های مغناطیسی استرپتاویدین تثبیت کرده و آن‌ها را با لیزات سلولی انکوبه کنند.

آنتی بادی ها به طور خاص پروتئین هدف و پروتئین های متقابل آن را جذب می کنند و یک مجموعه "پروتئین هدف آنتی بادی مهره مغناطیسی" را تشکیل می دهند. می توان آن را به سرعت تحت تأثیر میدان مغناطیسی خارجی با عملکرد ساده و حساسیت بالا جدا کرد. در آزمایشات تراشه، از دانه های مغناطیسی استرپتاویدین نیز برای گرفتن کمپلکس های پروتئین DNA بیوتینیله و مطالعه برهمکنش بین پروتئین ها و DNA استفاده شد.

3.3 آزمایش پایین کشیدن
در مطالعه برهمکنش‌های پروتئین{0}}پروتئین، دانه‌های مغناطیسی می‌توانند پروتئین‌های طعمه بیوتینیله شده را جذب کنند و سپس پروتئین‌های پیش‌پروتئینی را که با آنها برهم‌کنش می‌کنند «ماهی» کنند. به عنوان مثال، هنگام مطالعه مسیرهای سیگنالینگ کلیدی در سلول‌های تومور، آنتی‌بادی‌های خاصی که پروتئین P53 را تشخیص می‌دهند، روی دانه‌های مغناطیسی استرپتاویدین بی‌حرکت می‌شوند و با لیز سلول تومور انکوبه می‌شوند تا به طور موثر P53 و پروتئین‌های مرتبط با آن را غنی کنند. در مقایسه با روش‌های رسوب ایمنی سنتی، IP مهره مغناطیسی حساسیت و ویژگی بالاتری دارد و می‌تواند به طور موثرتری پروتئین‌های هدف را با فراوانی کم غنی کند.

3.4 RNA{1}}به پایین بکشید
دانه‌های مغناطیسی نیز برای آزمایش‌های{0}}کشش RNA مناسب هستند. پس از اتصال به دانه‌های مغناطیسی استرپتاویدین، پروب‌های RNA بیوتینیله می‌توانند پروتئین‌هایی را جذب کنند که با RNA از لیزات سلولی برای مطالعه شبکه‌های برهمکنش پروتئین RNA تعامل دارند.
3.5 تهیه DNA تک رشته ای و استخراج اسید نوکلئیک
این می تواند با الیگونوکلئوتیدهای بیوتینیله شده برای تهیه DNA تک رشته ای و استخراج موثر اسیدهای نوکلئیک متصل شود و نقش مهمی در شبیه سازی مولکولی و مهندسی ژنتیک ایفا کند.

4. تشخیص توان عملیاتی بالا و غربالگری دارو
4.1. TR-پلتفرم آزمایش FRET
می‌توان آن را با کلات‌های درخشان مانند کلات‌های یوروپیوم برای انجام پیوند سیگنال و گرفتن مولکولی در سیستم تشخیص TR-FRET (انتقال انرژی تشدید فلورسانس با زمان-حل‌شده) همراه کرد. به عنوان مثال، THUNDER™ استرپتاویدین با برچسب یوروپیوم که به طور خاص برای پلت فرم آزمایشی TR-FRET طراحی شده است، می تواند به طور پایدار به مولکول های مختلف اصلاح شده بیوتینیله متصل شود و به طور گسترده در تجزیه و تحلیل برهمکنش پروتئین و غربالگری اولیه داروهای هدف استفاده می شود.

این سیستم یکنواخت و توان عملیاتی-بالا دارد و آن را به ابزاری قدرتمند برای توسعه داروهای مدرن تبدیل می‌کند.

4.2 تحویل هدفمند دارو
خواص اتصال بیوتین آن، آن را به یک حامل ایده آل برای سیستم های تحویل هدفمند دارو تبدیل می کند. با جفت کردن مولکول های دارو با بیوتین و استفاده از توانایی اتصال هدفمند استرپتاویدین، می توان به تحویل دقیق دارو دست یافت، کارایی درمان را بهبود بخشید و عوارض جانبی را کاهش داد.

4.3 بیوسنسورها و بیوچیپ ها

این ماده اصلی برای تولید حسگرهای زیستی و تراشه‌های زیستی است. با تثبیت استرپتاویدین بر روی سطح تراشه به عنوان یک عنصر جذب، می توان پروب های پروتئین نشاندار شده با بیوتین یا آنتی بادی ها را روی آن تثبیت کرد، و به تشخیص- و حساسیت{2} بالا دست یافت. به عنوان مثال، در غربالگری اولیه تراشه های پروتئینی برای بیماری های قلبی عروقی، دانه های مغناطیسی استرپتاویدین بر روی بستر تراشه ثابت می شوند و برای اتصال پروب های پروتئین بیوتینیله استفاده می شوند. این می تواند به طور دقیق ناهنجاری ها را در بیماران در مراحل اولیه بیماری و زمانی که غلظت نشانگر خون به اندازه cTnI 0.01 نانوگرم در میلی لیتر است، تشخیص دهد و پنجره تشخیص را 2 تا 3 ساعت در مقایسه با روش های تشخیصی سنتی پیش می برد.

5. زیست شناسی سلولی و تصویربرداری
5.1 برچسب گذاری سطح سلول و مرتب سازی سلول های فلورسنت
استرپتاویدین نشاندار شده با فلورسنت (مانند Vari Fluor 488 Streptavidin) به طور گسترده برای برچسب گذاری سطح سلول و مرتب سازی سلول های فلورسنت استفاده می شود. طیف انتشار آن کل طیف نور مادون قرمز و مرئی-نزدیک را پوشش می‌دهد و در آزمایش‌های برچسب‌گذاری چند رنگ، می‌تواند به راحتی وارد هسته و ساختار سیتوپلاسمی شود، پروتئین‌های هدف را برای تصویربرداری و تجزیه و تحلیل برچسب‌گذاری کند.

5.2 نانوتکنولوژی و خود مونتاژ مواد
ویژگی‌های اتصال چهار ظرفیتی آن، آن را به یک پل ایده‌آل برای مونتاژ{0}خود نانومواد تبدیل می‌کند. از طریق اتصال هدفمند بیوتین استرپتاویدین، نانوساختارهای مختلفی را می توان برای تحقیقات بین رشته ای مانند تصویربرداری بیولوژیکی و پایش محیطی ساخت.

6. آنتی بادی ضد استرپتاویدین
با استفاده گسترده از سیستم بیوتین استرپتاویدین، یک مسئله اغلب نادیده گرفته شده است که - آنتی بادی های آنتی استرپتاویدین درون زا (ASA) در نمونه ممکن است با سیستم تشخیص تداخل داشته باشند. تحقیقات نشان داده است که اتصال ASA به SA در سیستم واکنش می تواند بر ساخت صحیح سیستم های آنتی بادی آنتی ژن خاص تأثیر بگذارد و در نتیجه دقت جفت، تشخیص یا نتایج تشخیصی به خطر بیفتد.

برای مقابله با این چالش، کیت‌های تشخیص آنتی‌بادی ضد استرپتاویدین پدیدار شده‌اند که می‌توانند برای شناسایی ASA درون‌زا در نمونه‌های بیمار و جلوگیری از تداخل آن با سیستم BAS استفاده شوند. Roche Custom Biotech یک جهش یافته استرپتاویدین غیرفعال (Streptavidin rec. inactive, poly) ایجاد کرده است که می تواند بدون گام های اضافی برای مسدود کردن و حذف تداخل ASA به سیستم فعلی اضافه شود و دقت و ویژگی سیستم تشخیص را بهبود بخشد.

7. تداخل بیوتین
اگرچه سیستم بیوتین استرپتاویدین قدرتمند است، اما با چالش شدید - تداخل بیوتین مواجه است.

هنگامی که غلظت بالایی از بیوتین آزاد در نمونه آزمایش وجود دارد، با آنتی بادی های بیوتینیله شده برای محل اتصال استرپتاویدین رقابت می کند و در نتیجه نتایج تشخیص مخدوش می شود.

تجویز خوراکی 100 میلی گرم بیوتین می تواند به حداکثر غلظت پلاسمایی 375-450 نانوگرم در میلی لیتر منجر شود. بیماران مبتلا به مولتیپل اسکلروزیس می توانند 300 میلی گرم در روز خوراکی مصرف کنند و سطح بیوتین پلاسمایی آنها می تواند بیش از 1000 نانوگرم در میلی لیتر باشد. مصرف روزانه 500 میلی گرم بیوتین می تواند منجر به غلظت بسیار بالای بیوتین در خون شود. در ایمونواسی ساندویچی، بیوتین بیش از حد می تواند نتایج نادرست و کم ایجاد کند. در ایمونواسی های رقابتی، می تواند منجر به نتایج بالای اشتباه شود.

مطالعات متعدد نشان داده اند که TSH، تیروکسین PTH، تست های غدد درون ریز مانند هورمون آدرنوکورتیکوتروپیک، پرولاکتین، تستوسترون، کورتیزول، و همچنین نشانگرهای تومور و نشانگرهای عملکردی قلب، همگی به درجات مختلفی تحت تاثیر تداخل بیوتین قرار دارند. FDA به طور متوالی اطلاعات هشدار و دستورالعمل های مربوطه را صادر کرده است. راهبردهای مقابله عبارتند از: رقت‌سازی سریال نمونه‌ها، تغییر به روش‌های غیر BAS مانند کروماتوگرافی مایع-طیف‌سنجی جرمی، آزمایش مجدد پس از پاکسازی بیوتین (به مدت کوتاه 2 ساعت، تا 15 روز یا حتی ماه)، یا استفاده از جاذب‌کننده‌های بیوتین رایگان.