اسید ال تیوگلوتامیکیک ترکیب محصول طبیعی است که از پیش سازهای گلوکوزینولات مانند در سبزیجات گرانیموندا مانند کلم پیچ، سبزی خردل و کلم بروکلی تبدیل می شود. اثرات سلامتی مختلفی دارد و به طور گسترده ای برای پیشگیری از بیماری های مزمن مانند سرطان، بیماری های قلبی عروقی و دیابت استفاده می شود. به طور گسترده ای در گیاهان چلیپایی مانند کلم پیچ، گل کلم و کلم یافت می شود. دارای فعالیت های فارماکولوژیک زیادی مانند ضد سرطان، ضد التهاب، آنتی اکسیدان، محافظت کننده عصبی و غیره می باشد بنابراین روش مصنوعی L-thioglutamic اسید توجه زیادی را به خود جلب کرده است.
در حال حاضر روشهای سنتز L-thioglutamic اسید را میتوان به دو دسته تقسیم کرد: تخمیر بیولوژیکی و سنتز شیمیایی. این دو روش در زیر به تفصیل توضیح داده شده است.
روش تخمیر بیولوژیکی ال-سولفورافان:
روش تخمیر بیولوژیکی روشی برای سنتز ترکیبات با میکروارگانیسم ها است. از طریق غربالگری سویههای باکتریایی و بهینهسازی شرایط کشت، میکروارگانیسمها میتوانند اسید L-thioglutamic را در طول فرآیند تخمیر تولید کنند. اکنون مشخص شده است که بسیاری از سویه ها می توانند اسید ال تیوگلوتامیک را سنتز کنند، مانند اشریشیا کلی، استرپتوکوکوس ترموفیلوس و غیره. در میان آنها، روش سنتز L-thioglutamic اسید توسط سویه های ارائه شده توسط Escherichia coli رایج ترین است. مراحل مشخص به شرح زیر است:
1. جداسازی سویه های مولد ال تیوگلوتامات، مانند اشریشیا کلی، از خاک یا بافت گیاه.
2. محیط و شرایط کشت مناسب مانند دما، مقدار pH، زمان کشت و غیره را برای کشت اشریشیا کلی اتخاذ کنید.
3. آبگوشت تخمیر اشریشیا کلی را برداشت کنید، فرآوری و خالص سازی خاصی را انجام دهید و L-thioglutamic اسید را بدست آورید.
روش سنتز شیمیایی ال-سولفورافان:
روش سنتز شیمیایی استفاده از روش واکنش مولکولی شیمیایی برای سنتز اسید L-تیوگلوتامیک از طریق مسیرهای مختلف مصنوعی است. در حال حاضر روش های سنتز شیمیایی عمدتاً به چهار نوع تقسیم می شوند: روش نمک کولین، روش سولفوریل کلرید، روش احیای کربونیل و روش سولفات آگارز.
1. روش نمک کولین:
این روش یکی از روش های متداول مصنوعی است. به صورت زیر عمل کنید:
① ابتدا، ال-متیونین و کولین در شرایط اسیدی واکنش داده می شوند تا یک جایگزین نیتروژن کمیاب از اسید L-تیوگلوتامیک تولید شود.
② گرم کردن و هیدرولیز کردن جایگزین های نیتروژن به اسید ال تیوگلوتامیک در شرایط قلیایی.
مزیت این روش این است که واکنش ساده و تسلط بر آن آسان است، اما بازده پایین است.
2. روش سولفونیل کلرید:
این روش از واکنش جایگزینی الکتروفیلیک برای سنتز اسید L-تیوگلوتامیک استفاده می کند. به صورت زیر عمل کنید:
① واکنش L-متیونین و سولفونیل کلرید در شرایط قلیایی برای به دست آوردن سولفینات اسید L-thioglutamic.
② سولفینات تحت شرایط قلیایی هیدرولیز می شود تا اسید ال تیوگلوتامیک تولید شود.
مزیت این روش این است که واکنش آسان کنترل می شود و بازده بالا است، اما نیاز به استفاده از سولفونیل کلرید سمی دارد.
3. روش احیای کربونیل:
روش استفاده از واکنش احیا برای سنتز اسید L-thioglutamic است. به صورت زیر عمل کنید:
① ال- متیونین با استونیمین واکنش می دهد و همزمان پیریدین پیریمیدین{-4-و پیریمیدین پیریمیدین-2-en{4}}یک{5}}سولفات تولید می کند.
②پیرمیدین پیریمیدین-2-en-4-یک-5-سولفات برای به دست آوردن اسید ال تیوگلوتامیک احیا میشود.
4. روش سولفات آگارز: این روش واکنش ال-متیونین و سولفات آگارز در شرایط اسیدی برای تولید اسید ال-تیوگلوتامیک است. به دلیل فعالیت کاتالیزوری خوب سولفات، راندمان واکنش و گزینش پذیری بهبود می یابد. عملکرد بالاتر، اما دست و پا گیرتر است.
در تحقیقات علمی، تشخیص ال-سولفورافان بسیار مهم است. در این میان روش سولفات آگارز یکی از روش های کلاسیک تشخیص است. در ادامه روش سولفات آگارز و مراحل آن به تفصیل توضیح داده خواهد شد.
اصل تجربی
روش سولفات آگارز بر اساس تشکیل کمپلکس زرد رنگ L-تیوگالاکتوپیکرین و سولفات باریم، نمکی است که در شرایط اسیدی تشکیل میشود و از آگارز به عنوان داربست برای جداسازی L- روش سولفورافان استفاده میشود. این روش مبتنی بر این واقعیت است که در شرایط اسیدی، کمپلکس زرد رنگی که در اثر واکنش سولفات باریم و ال-سولفورافان ایجاد میشود، به راحتی در آب حل نمیشود و در آگارز رسوب میکند تا ال-سولفورافان جدا و شناسایی شود.
مراحل آزمایشی:
مرحله 1: سوسپانسیون سولفات آگارز باریم را آماده کنید
مقدار مناسبی آگارز و سولفات باریم را وزن کرده، مقدار معینی آب مقطر را پس از مخلوط کردن اضافه کرده و کاملاً هم بزنید، حرارت دهید تا حل شود یا یکنواخت مخلوط شود، سوسپانسیون را با فیلتری با اندازه منافذ 0.22 میکرومتر فیلتر کنید و سپس به مدت 3 تا 5 دقیقه بجوشانید. هنگامی که سوسپانسیون تا دمای زیر 50 درجه خنک شد اما هنوز جامد نشد، محلول را در ظرف پتری ریخته و در دمای اتاق قرار دهید تا جامد شود.
مرحله 2: آماده سازی و پردازش نمونه:
نمونه یا استاندارد مورد آزمایش را وزن کنید، به مقدار کافی {{{0}} اضافه کنید.0محلول پیروفسفات سدیم 1 مولار برای حل کردن، حجم متناظر کلروفرم را برای استخراج اضافه کنید، به مدت 10-15 دقیقه سانتریفیوژ کنید. مایع لایه بالایی را برداشته، کلروفرم را تبخیر کرده تا باقیمانده جمع شود، 2 میلی لیتر آب و 2 میلی لیتر اسید کلریدریک غلیظ به آن اضافه کنید، دوباره با کلروفرم استخراج شده، سانتریفیوژ شده و لایه بالایی گرفته شد. 24 میلی لیتر از مایع بالایی را بردارید، 0.2 میلی لیتر محلول نیترات مس 2 درصد و 0.4 میلی لیتر محلول نیترات سرب 5 درصد را اضافه کنید، یک بار با کلروفرم عصاره بگیرید، سانتریفیوژ کنید و مایع بالایی را بگیرید که می تواند به عنوان نمونه آزمایشی برای آزمایش استفاده شود.
مرحله 3: آزمایش تحلیل مجدد:
نمونه ها به سوسپانسیون آگارز-باریم سولفات اضافه شدند و در حمام آب حرارت داده شدند تا در دمای 80 درجه به مدت 2 ساعت جامد شوند. پس از جامد شدن نمونه، سوسپانسیون سولفات آگارز-باریم تا دمای اتاق خنک می شود و کمپلکس نمونه سولفات آگارز-باریم در شرایط بافر اسید سیتریک و نمک آمونیوم حل می شود. در نهایت، به طور متوالی با آب بشویید و رنگ کمپلکس را در کره آگارز به صورت چشمی بررسی کنید.
مرحله 4: تجزیه و تحلیل نتایج:
جذب فیلتر را پس از آنالیز مجدد اندازه گیری کنید تا یک منحنی استاندارد بسازید و در نتیجه محتوای ال-سولفورافان را بدست آورید.
روش سولفات آگارز یک روش کلاسیک برای جداسازی و تشخیص ال-سولفورافان است. از طریق یک سری مراحل می توان ال-سولفورافان را جدا کرد و محتوای آن را تشخیص داد. این روش دارای مزایای سادگی، حساسیت بالا و نتایج دقیق است و معمولاً در تشخیص ال-سولفورافان در مواد غذایی، لوازم آرایشی و دارویی استفاده می شود.
خلاصه: با پیشرفت علم و فناوری، روش سنتز L-thioglutamic acid به طور مداوم در حال بهینه سازی و بهبود است. در عین حال، روش تخمیر بیولوژیکی و روش سنتز شیمیایی نیز مزایا و معایب خاص خود را دارند و اینکه از کدام روش استفاده شود بستگی به وضعیت واقعی دارد.