چگونه GS-441524 باعث خاتمه زودرس RNA ویروسی می شود

تزریقات GS-441524 از تکثیر ژنتیکی ویروس‌ها جلوگیری می‌کند و درمان را تغییر می‌دهد. به دلیل یک مکانیسم بیولوژیکی پیچیده، این آنالوگ نوکلئوتیدی ممکن است از تکثیر ویروس کرونا جلوگیری کند.

این دارو علائم را پنهان می کند و مکانیسم های اساسی ویروس را برای تکثیر در سلول های میزبان هدف قرار می دهد. متخصصان دامپزشکی کشف کردند که چگونه آنزیم ها این ماده شیمیایی را به شکل فعال آن در سلول های بیمار تبدیل می کنند. متابولیت تولید شده به تکثیر ویروسی می پیوندد و یک سد مولکولی ایجاد می کند که ویروس را از تولید مثل ژن هایش مسدود می کند. این شیوه عمل رویکرد ضد ویروسی را ارتقا می‌دهد و گربه‌ها را با بیماری‌های غیر قابل درمان امیدوار می‌کند.

کروناویروس گربه برای کپی کردن مواد ژنتیکی خود به فرآیندهای آنزیمی دقیق درون سلول‌هایش متکی است. هنگامی که تزریق GS-441524 به سلول آسیب دیده می رود، توسط کینازهای طبیعی به شکل تری فسفات تبدیل می شود.

این متابولیت فعال شده بسیار شبیه آدنوزین تری فسفات است، که یک بلوک ساختمانی طبیعی است که RNA پلیمراز وابسته به RNA ویروسی معمولاً هنگام ساخت به ژنوم اضافه می کند.

جذب سلولی و فعال سازی متابولیک

پروتئین‌های ناقل نوکلئوزیدی به سلول‌های گربه کمک می‌کنند تا دارو را در غشای خود حرکت دهند.

هنگامی که این ترکیب وارد آن می شود، با گروهی از آنزیم های فسفوریلاسیون ملاقات می کند که گروه های فسفات را یکی پس از دیگری اضافه می کنند. از طریق این سه مرحله، مولکول زیست فعال تری فسفات با کیفیت ضد ویروسی ساخته می شود. فقط فرم کاملاً فسفریله شده می‌تواند تکثیر ویروس را متوقف کند، بنابراین نحوه عملکرد این فرآیند تغییر تأثیر مستقیمی بر عملکرد خوب درمان دارد.

آنزیم‌های کیناز که این فعال‌سازی را انجام می‌دهند، تمایل زیادی به این ترکیب دارند، به این معنی که در بافت‌های آلوده به سرعت تغییر می‌کند. مطالعات روی ماکروفاژهای صفاقی گربه نشان می دهد که مولکول فعال در عرض چند ساعت پس از تزریق به بالاترین سطوح خود در داخل سلول ها می رسد.

آنزیم‌های کیناز که این فعال‌سازی را انجام می‌دهند، تمایل زیادی به این ترکیب دارند. این بدان معناست که به سرعت در بافت‌های آلوده تغییر می‌کند. مطالعات روی ماکروفاژهای صفاقی گربه‌سان نشان می‌دهد که مولکول فعال در عرض چند ساعت پس از تزریق به بالاترین سطح خود در داخل سلول می‌رسد. این جدول زمانی فعال سازی سریع توضیح می دهد که چرا پس از شروع درمان، پیشرفت های بالینی خیلی سریع اتفاق می افتد.

اتصال رقابتی به پلیمراز ویروسی

آنزیم RNA پلیمراز وابسته به RNA ویروسی - نمی تواند تفاوت بین شکل فعال دارو و آدنوزین تری فسفات طبیعی را تشخیص دهد.

این دو مولکول برای یک نقطه در مرکز فعال پلیمراز که در آن می توانند متصل شوند با هم رقابت می کنند. هنگامی که آنزیم ویروس آنالوگ را به جای نوکلئوتید معمولی اضافه می کند، باعث می شود زنجیره RNA در حال رشد بلوک ساختمانی بدی داشته باشد. این فریب در سطح مولکولی باعث می شود مکانیسم درمانی کار کند. آنزیم پلیمراز به طور منظم به کار خود ادامه می دهد تا زمانی که سعی کند زنجیره را طولانی تر از آنالوگ قبلی کند.

در آن نقطه، تفاوت در ساختار بین دارو و نوکلئوتید طبیعی بسیار مهم می شود.

بخش قند تغییر یافته ترکیب، گروه شیمیایی لازم برای ایجاد پیوند فسفودی استر بعدی را ندارد، بنابراین در یک بن بست مولکولی گیر کرده است.

مکانیسم بلوک گسترش زنجیره

برای اینکه آنزیم های پلیمراز ویروسی بلوک ساختمانی بعدی را به هم متصل کنند، به یک گروه هیدروکسیل 3'{{1} آزاد روی نوکلئوتید انتهایی نیاز دارند. پس از اضافه شدن،تزریق GS-441524متابولیت یک موقعیت 3' تغییر یافته دارد که امکان گسترش زنجیره بیشتری را نمی دهد. آنزیم پلیمراز در این مرحله از کار می ایستد و قادر به افزودن نوکلئوتیدهای بیشتر یا خلاص شدن از شر آنالوگ مشکل ساز نیست.

تجزیه و تحلیل کریستالوگرافی به محققان کمک کرده است تا بفهمند آنالوگ دقیقاً در کجای محل فعال پلیمراز قرار دارد.

متأسفانه، خطای آنزیم{0}}در بررسی سیستم‌ها فوراً اشتباه را تشخیص نمی‌دهد، بنابراین آنالوگ بخشی از زنجیره در حال رشد باقی می‌ماند.

به دلیل این تشخیص دیرهنگام، پلیمراز زمان و انرژی زیادی را صرف تلاش برای تکثیر می کند که کار نمی کند، که توانایی ویروس برای ساخت DNA جدید را کاهش می دهد.

چندین فرآیند شیمیایی با هم کار می کنند تا سنتز RNA ویروسی را متوقف کنند، که به نوبه خود مانع از ساخت ژنوم های فعال کروناویروس می شود. با درک این مراحل به ترتیب، می توانید ببینید که چگونه یک ترکیب واحد می تواند به طور موثر تکثیر چندین سویه کروناویروس را متوقف کند.

تغییرات ساختاری پلیمراز

وقتی RNA پلیمراز وابسته به ویروس RNA{0}} مولکول فعال را اضافه می کند، ساختار کمپلکس آنزیمی به روش های کوچکی تغییر می کند. این تغییرات در شکل، حرکت پلیمراز در طول الگوی RNA را دشوارتر می کند.

هنگامی که آنالوگ وجود دارد، آنزیم پس از هر بار افزودن یک نقطه نوکلئوتیدی به سمت جلو حرکت نمی کند، مانند آن که معمولاً انجام می شود.

مطالعات با استفاده از تصویربرداری با وضوح بالا نشان می‌دهد که پلیمراز زمانی که سعی می‌کند از آنالوگ موجود فراتر رود گیر می‌کند. بقایای کاتالیزوری موجود در محل فعال آنزیم نسبت به بستر از جای خود خارج می شوند که از تشکیل پیوندهای فسفودی استر جدید جلوگیری می کند. این مشکل ساختاری همچنان رخ می دهد زیرا آنزیم راهی برای خنثی کردن ترکیب یا حرکت در اطراف برای دور زدن آن ندارد.

تجمع ژنوم های ویروسی کوتاه شده

چندین آنزیم پلیمراز با آنالوگ اضافه شده در نقاط مختلف در امتداد مولکول های قالب مختلف روبرو می شوند. این باعث می شود که سلول های آلوده تعداد زیادی از قطعات RNA ویروسی ناتمام را جمع آوری کنند.

این ژنوم های کوتاه شده، اطلاعات ژنتیکی مهمی را که برای ساخت پروتئین های ویروسی لازم است، از دست داده اند. وقتی این ژن‌های شکسته کنار هم قرار می‌گیرند، ذرات ویروس نمی‌توانند عفونت‌های جدیدی را ایجاد کنند، که حلقه تکثیر را متوقف می‌کند. یک مطالعه آماری روی جمعیت‌های RNA ویروسی در سلول‌هایی که تحت درمان قرار گرفته‌اند، تغییر بزرگی را به سمت گونه‌های RNA کوتاه‌تر نشان می‌دهد.

افزودن تصادفی آنالوگ به ژنوم ویروسی را می توان در توزیع این ژنوم های کوتاه شده مشاهده کرد. این الگوی تصادفی اطمینان حاصل می کند که تقریباً تمام تلاش ها برای تکرار حداقل یک آنالوگ گنجانده شده را برآورده می کند. این امر باعث می‌شود که از نظر آماری بعید باشد که ویروس بتواند ژنوم‌هایی بسازد که کاملاً کاربردی و مسری باشند.

کاهش واسطه های تکثیر ویروسی

برای تکثیر کروناویروس، باید هم RNA ژنومیک-طولانی و هم گونه‌های RNA زیرژنومیک کوتاه‌تر را بسازد. این دارو به طور همزمان بر هر دو فرآیند تأثیر می‌گذارد.

همانطور که آنزیم های پلیمراز بر روی قالب های مختلف گیر می کنند، قطعاتی که کار نمی کنند شروع به حکمرانی بر مخزن واسطه های تکرار می کنند. این کاهش، فرآیندهایی را متوقف می‌کند که به این واسطه‌ها برای ساخت پروتئین‌های ویروسی نیاز دارند. فعالیت مصنوعی که هنوز ادامه دارد عمدتاً رونوشت هایی می سازد که تمام نمی شوند و به سرعت توسط هسته های سلولی تجزیه می شوند. هنگامی که سنتز کند می شود و سرعت تخریب افزایش می یابد، محیطی خصمانه برای تکثیر ویروس ایجاد می کند که خلاص شدن از شر عفونت را آسان تر می کند.

توقف زودهنگام تکثیر ژنوم ویروسی به دلیل ویژگی های شیمیایی خاص آنالوگ اضافه شده و محدودیت های نحوه عملکرد آنزیم های پلیمراز است. سنتز RNA ویروس نمی تواند فراتر از نقطه ترکیب آنالوگ پیش رود، زیرا تعدادی از عوامل با هم کار می کنند.

عدم وجود 3'-قابلیت گسترش هیدروکسیل

مهمترین چیز برای گسترش زنجیره RNA این است که گروه 3'-هیدروکسیل نوکلئوتید نهایی به آلفا-فسفات نوکلئوتید تری فسفات وارد شده حمله کند.

پس از اضافه شدن،تزریق GS-441524محصول دارای موقعیت 3 تغییر یافته است که باعث می شود نتواند در این فرآیند شرکت کند. از آنجایی که گروه هیدروکسیل واکنشی ندارد، نمی‌توان آن را بیش از این گسترش داد. مطالعات با استفاده از آنزیم‌های پلیمراز خالص و بیوشیمی نشان می‌دهد که آنالوگ اضافه‌شده یک پایان‌دهنده زنجیره کامل است. این آنزیم نمی‌تواند نوکلئوتیدها را به گذشته از نقطه آنالوگ اضافه کند، حتی زمانی که شرایط برای فعالیت پلیمراز خوب است و زیرلایه‌های زیادی وجود دارد. این انسداد کامل، دارو را از سایر داروهای ضد ویروسی متفاوت می کند که فقط تکثیر را بدون توقف کامل کند می کنند.

موانع انرژی برای حذف آنالوگ

سیستم های تصحیح پلیمراز معمولاً با استفاده از فعالیت اگزونوکلئاز از شر نوکلئوتیدهایی که به اشتباه اضافه شده اند خلاص می شوند. RNA پلیمراز وابسته به RNA ویروس مانند DNA پلیمرازها نمی تواند اشتباهات را بررسی کند، اما می تواند از شر برخی نوکلئوتیدهای نادرست خلاص شود. با این حال، آنالوگ اضافه شده جفت‌های پایه پایدار با الگو ایجاد می‌کند تا عملکردهای ویرایش آنزیم نتوانند از شر آن خلاص شوند. آزمایش‌های ترمودینامیکی نشان می‌دهند که انرژی اتصال بین آنالوگ اضافه‌شده و پایه الگوی منطبق با آن نزدیک به انرژی اتصال طبیعی واتسون{4}}جفت‌های پایه کریک است.

این پایداری تجزیه خود به خودی را متوقف می‌کند و باعث می‌شود آنزیم‌ها ماده را از نظر انرژی حذف کنند. پلیمراز در حالت توقف گیر کرده است و نمی تواند در فرآیند گنجاندن به جلو یا عقب برود.

اثر تجمعی بر تناسب اندام ویروسی

از آنجایی که ژنوم‌های کروناویروس بسیار بزرگ هستند، هر رویداد گنجاندن ممکن است مهم به نظر نرسد. شانس ترکیب آنالوگ در هر نقطه مشخص بر اساس میزان متابولیت فعال در داخل سلول در مقایسه با آدنوزین تری فسفات طبیعی است.

دوز درمانی نسبت‌هایی را ایجاد می‌کند که اطمینان حاصل می‌کند که چندین رویداد ادغام برای هر تلاش برای کپی کردن ژنوم وجود دارد.

بر اساس نرخ‌های ادغام اندازه‌گیری شده و مدل‌سازی آماری، تصور می‌شود که ژنوم‌های کروناویروس به طور متوسط ​​از چندین ترکیب آنالوگ در طول هر چرخه تولید مثل عبور می‌کنند. از آنجایی که تعداد آنها بسیار زیاد است، مکانیسم پایان کار اضافی است. این بدان معنی است که حتی اگر یک آنالوگ گسترش را متوقف نکند، آنالوگ های بعدی تکرار را متوقف می کنند. در شرایط درمانی، شانس ساختن یک ژنوم کامل-که هیچ آنالوگ ندارد تقریباً به هیچ می‌رسد.

ویروس کرونای گربه به دلیل نحوه سازماندهی ژنوم و نحوه عملکرد دستگاه تکثیر آن در برابر تاکتیک هایی که به زنجیره ها پایان می دهد آسیب پذیر است. این دارو از این نقاط ضعف بسیار دقیق استفاده می کند و تأثیر کمی بر نحوه عملکرد سلول میزبان دارد و در عین حال بیشترین اثرات ضد ویروسی را دارد.

انتخاب پذیری برای پلیمراز ویروسی

سلول های پستانداران دارای آنزیم های پلیمراز زیادی هستند که DNA را کپی می کنند، DNA را تثبیت می کنند و ژنوم میتوکندری را به روز نگه می دارند. ایمنی ازتزریق GS-441524به این واقعیت بستگی دارد که RNA پلیمراز وابسته به ویروس را بیشتر از آنزیم های میزبان هدف قرار می دهد.

دلیل این گزینش پذیری تفاوت در ساختار بین پلیمرازهای ویروسی و پستانداران است.مطالعات اتصال مقایسه ای نشان می دهد که متابولیت فعال شده بسیار قوی تر از اتصال به DNA پلیمراز پستانداران به پلیمراز کروناویروس متصل می شود.

ساختار سایت فعال RNA پلیمراز وابسته به RNA ویروسی-جایگزینی آنالوگ را نسبت به پلیمرازهای میزبان آسان‌تر می‌کند. این تمایل متفاوت یک پنجره درمانی ایجاد می کند که در آن تکثیر ویروس به شدت متوقف می شود در حالی که تولید اسید نوکلئیک سلول میزبان عمدتاً ثابت می ماند.

تاثیر بر سنتز RNA زیر ژنومی ویروسی

کروناویروس‌ها گروهی از مولکول‌های RNA را می‌سازند که درون یکدیگر قرار گرفته‌اند. این مولکول های RNA به عنوان راهنما برای ترجمه پروتئین های ساختاری و کمکی عمل می کنند. این RNA های زیر ژنومی توسط ماشین های تولید مثل با استفاده از روشی به نام رونویسی نامنظم ساخته می شوند.

تزریق داروی GS-441524 چندین مرحله را در این فرآیند متوقف می‌کند، که تولید پروتئین‌های ویروسی مورد نیاز برای کنار هم قرار دادن ذرات عفونی را متوقف می‌کند. زمانی که جمعیت‌های RNA ویروسی در سلول‌های تحت درمان بررسی می‌شوند، مشخص می‌شود که همه گونه‌های RNA زیر ژنومی بسیار کاهش یافته‌اند. زیرا به بیش از یک دور تنظیم همزمان پلیمراز برای شروع و شروع فرآیند بسیار نیاز دارد. حساس به خاتمه زنجیره

هر رویداد رونویسی شانس گنجاندن آنالوگ را می‌دهد، به این معنی که سنتز RNA زیر ژنومی به طور قابل‌توجهی نسبت به فرآیندهای- تک گذری تحت تأثیر قرار می‌گیرد.

زمان-کاهش بار ویروسی وابسته

مطالعات بالینی گربه هایی که تحت درمان هستند نشان می دهد که بار ویروسی به روش های مورد انتظار کاهش می یابد. سطح RNA ویروس در خون، مایع صفاقی و بافت ها تنها چند روز پس از شروع درمان به روش لگاریتمی شروع به کاهش می کند. این نمایه جنبشی اثرات ترکیبی توقف ایجاد ژنوم های ویروسی جدید و اجازه دادن به ژنوم های ویروسی موجود را نشان می دهد که به طور طبیعی تجزیه شوند.

بر اساس میزان ادغام اندازه‌گیری شده و پایداری ژنوم، مدل‌سازی ریاضی نحوه تغییر ویروس‌ها در طول درمان می‌تواند نرخ‌های پاکسازی مشاهده شده را تخمین بزند.

مدل‌ها نشان می‌دهند که تعداد تولید مثل مؤثر ویروس به‌زودی پس از رسیدن به مقادیر مناسب دارو به زیر یک می‌رسد.

این تغییر از عفونت مولد به پاکسازی ویروس، مانع درمانی کلیدی است که بر عملکرد درمان تأثیر می‌گذارد.